Dnia 25 kwietnia obchodzimy Międzynarodowy Dzień DNA, ustanowiony na pamiątkę publikacji przełomowego artykułu w czasopiśmie Nature z 1953 roku, w którym James D. Watson i Francis H. Crick przedstawili model struktury przestrzennej DNA – podwójną helisę (1). Był to punkt zwrotny w historii biologii molekularnej, który dał początek nowoczesnej genetyce i otworzył drogę do rozwoju diagnostyki molekularnej, farmakogenomiki oraz medycyny spersonalizowanej.

Cytując słowa autorów przełomowego artykułu:

„It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.„(1)

Nie możemy również zapominać o Rosalind Franklin, bez której kluczowych danych – w szczególności słynnego zdjęcia dyfrakcyjnego Photo 51 – model helisy DNA prawdopodobnie nie zostałby tak szybko i trafnie zaproponowany (2).

Rys historyczny

• 1869 – Friedrich Miescher izoluje z jąder leukocytów substancję, którą nazywa „nukleiną” – wstępna identyfikacja DNA (3).
• 1952 – Alfred Hershey i Martha Chase dowodzą, że to DNA, a nie białka, jest nośnikiem informacji genetycznej (4).
• 1953 (25 kwietnia) – James D. Watson i Francis H. Crick, korzystając z danych dyfrakcyjnych Rosalind Franklin, publikują w Nature model struktury helikalnej DNA (1).
• 1983 – Kary Mullis opracowuje metodę PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy), rewolucjonizując analizę DNA (5).
• 2003 (14 kwietnia) – ogłoszenie ukończenia projektu Human Genome Project, czyli pełnej sekwencji genomu człowieka (6).
• Od 2012 – rozwój technologii CRISPR-Cas9, umożliwiającej precyzyjną edycję genomu, zapoczątkowany publikacją zespołu Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier (7).

Budowa i funkcje DNA

Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) to dwuniciowa, helikalna cząsteczka zbudowana z nukleotydów, zawierających zasady azotowe: adeninę (A), tyminę (T), cytozynę (C) i guaninę (G). DNA pełni funkcję magazynowania i przekazywania informacji genetycznej. Służy jako matryca dla transkrypcji RNA, a następnie RNA bierze udział w translacji białek.

Ludzki genom składa się z około 3,2 miliarda par zasad i zawiera około 19 000–20 000 genów kodujących białka, z czego jedynie około 1,5% genomu pełni funkcję kodującą. Pozostała część zawiera elementy regulacyjne, strukturalne, a także regiony o nieznanej funkcji, z których część bierze udział w mechanizmach epigenetycznych.

Mitochondrialne DNA (mtDNA)

Oprócz DNA jądrowego człowiek posiada również mitochondrialne DNA (mtDNA), zlokalizowane w macierzy mitochondriów. Ma ono postać kolistej cząsteczki o długości 16 569 par zasad i zawiera 37 genów: 13 kodujących białka łańcucha oddechowego, 22 tRNA i 2 rRNA.

Mitochondrialne DNA jest dziedziczone niemal wyłącznie w linii matczynej, gdyż podczas zapłodnienia mitochondria plemnika ulegają degradacji. Ta właściwość pozwala na szerokie wykorzystanie mtDNA w genealogii genetycznej, identyfikacji osobniczej oraz w badaniach chorób mitochondrialnych, których dziedziczenie często przybiera postać matczyną.

Ciekawostką jest to, że wielu diagnostów zajmujących się wykrywaniem autoprzeciwciał ma do czynienia z mtDNA. W diagnostyce tocznia rumieniowatego układowego (SLE) stosuje się test immunofluorescencji pośredniej z wykorzystaniem wiciowca Crithidium luciliae, którego kinetoplast zawiera dwuniciowe DNA (dsDNA). Ten unikalny substrat pozwala wykryć obecność przeciwciał przeciw dsDNA, które są charakterystyczne dla SLE. Kinetoplast to wyspecjalizowany obszar mitochondriów w komórkach wiciowców z grupy kinetoplastydów (Kinetoplastida). Jest to miejsce, gdzie znajduje się DNA kinetoplastyczne (kDNA), czyli unikalny, niezwykle złożony rodzaj mtDNA, który występuje tylko u wiciowców (8).

Rysunek 1. Obraz immunofluorescencji pośredniej (IIFT) z wykorzystaniem Crithidia luciliae – obecność fluorescencji w kinetoplastach wskazuje na obecność przeciwciał anty-dsDNA w surowicy pacjenta.

Ojcowskie mtDNA – wyjątek od reguły?

Dziedziczenie ojcowskiego mtDNA przez dekady uznawano za niemożliwe. Jednak w 2018 roku w czasopiśmie „PNAS” („Proceedings of the National Academy of Sciences”) opublikowano pracę dokumentującą przypadki dwuliniowego dziedziczenia mtDNA u kilkorga pacjentów. Jako hipotetyczny mechanizm tego zjawiska wskazuje się mutację w systemie odpowiedzialnym za degradację mitochondriów pochodzenia ojcowskiego po zapłodnieniu (9). Chociaż zjawisko to występuje niezwykle rzadko, jego obecność może mieć istotne implikacje dla analizy rodowodów oraz interpretacji wyników badań genetycznych.

Historia i znaczenie PCR – przełom w diagnostyce molekularnej

Jednym z najważniejszych osiągnięć w historii biologii molekularnej – zaraz obok odkrycia struktury DNA – było opracowanie metody reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Historia odkrycia

Metodę PCR opracował w 1983 roku amerykański biochemik Kary B. Mullis. Zauważył on, że stosując polimerazę DNA, można w warunkach laboratoryjnych namnożyć określony fragment DNA w sposób eksponencjalny, wykorzystując cykliczne zmiany temperatury. Pomysł był rewolucyjny i został opublikowany w 1987 roku – umożliwił selektywne kopiowanie nawet bardzo małych ilości DNA w zaledwie kilka godzin (5).

W 1993 roku Mullis otrzymał za to odkrycie Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii, a metoda PCR szybko zrewolucjonizowała diagnostykę medyczną, kryminalistykę, badania wirusologiczne, genetykę sądową, archeogenomikę i wiele innych dziedzin (10).

PCR dziś – filar nowoczesnej diagnostyki

Obecnie PCR jest jedną z podstawowych metod wykorzystywanych w diagnostyce molekularnej. Istnieje wiele modyfikacji techniki, w tym:

• real-time PCR (qPCR) – umożliwia ilościową analizę DNA/RNA w czasie rzeczywistym,

• RT-PCR – stosowana do detekcji RNA wirusowego (np. SARS-CoV-2, grypy). W czasie pandemii COVID-19 metoda RT-PCR stała się złotym standardem diagnostycznym na skalę globalną, a laboratoria molekularne w ciągu kilku miesięcy osiągnęły niespotykaną wcześniej przepustowość i poziom automatyzacji,

• digital PCR – oferująca wysoką czułość i dokładność w detekcji niskopoziomowych wariantów,
• multiplex PCR – umożliwiająca jednoczesne wykrywanie wielu gneów w jednej reakcji.

Podsumowanie

Dzięki odkryciu struktury DNA oraz opracowaniu metody PCR możliwa stała się rewolucja w medycynie laboratoryjnej. Obecnie trudno wyobrazić sobie diagnostykę bez wykorzystania biologii molekularnej – od testów prenatalnych, przez diagnostykę onkologiczną, po precyzyjne i szybkie wykrywanie patogenów i wsparcie leczenia spersonalizowanego.

Z okazji Międzynarodowego Dnia DNA warto podkreślić znaczenie tej cząsteczki dla rozwoju nauk biomedycznych oraz wyrazić uznanie dla zespołów diagnostycznych i klinicznych, które każdego dnia wykorzystują wiedzę genetyczną w praktyce klinicznej.

Piśmiennictwo:

1. Watson, J.D., & Crick, F.H.C. (1953). Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature, 171(4356), 737–738. https://doi.org/10.1038/171737a0
2. Maddox, B. (2002). Rosalind Franklin: The Dark Lady of DNA.
3. Dahm, R. (2005). Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Developmental Biology, 278(2), 274–288.
4. Hershey, A.D., & Chase, M. (1952). Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. The Journal of General Physiology, 36(1), 39–56.
5. Mullis, K., & Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase chain reaction. Methods in Enzymology, 155, 335–350.
6. Collins, F.S., et al. (2003). A vision for the future of genomics research. Nature, 422(6934), 835–847.
7. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816–821.
8. Shapiro TA, Englund PT. (1995). The structure and replication of kinetoplast DNA. Annu Rev Microbiol.
9. Luo S, Valencia CA, Zhang J, et al. (2018). Biparental Inheritance of Mitochondrial DNA in Humans. PNAS, 115(51), 13039–13044. DOI: 10.1073/pnas.1810946115

https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/mullis/facts/