Firma EUROIMMUN Polska została dystrybutorem produktów oraz urządzeń Oxford Immunotec na terenie Polski. Od prawie 20 lat testy produkowane przez firmę Oxford Immunotec, oparte na technologii ELISPOT, mają zastosowanie w diagnostyce chorób, w których dochodzi do odpowiedzi ze strony limfocytów T, w tym gruźlicy oraz COVID-19. ELISPOT wykorzystuje naturalny mechanizm wytwarzania przez limfocyty T cytokin, takich jak interferon gamma. Technika ta należy zatem do tzw. testów IGRA (ang. Interferon Gamma Release Assay) mierzących wydzielany przez komórki interferon. Używana jest w wielu dziedzinach badań – zarówno naukowych, jak i diagnostycznych, w tym w wakcynologii, alergologii, onkologii oraz monitorowaniu chorób zakaźnych i autoimmunologicznych. W tym filmie wyjaśniamy, na czym polega technologia ELISPOT i jak przebiega procedura wykonania testu T-SPOT. Dowiesz się również, jakiej grupie pacjentów testy oparte na technologii ELISPOT są dedykowane w szczególności, oraz zapoznasz się z głównymi różnicami między różnymi testami typu IGRA.

01:06 Zasada działania testu ELISPOT

03:55 Porównanie technik ELISPOT i ELISA w ocenie odpowiedzi komórkowej

6:11 Kiedy warto wybrać test oparty o metodę ELISPOT?

Metoda ELISPOT (ang. Enzyme-Linked Immunospot Assay) przeznaczona jest do oceny komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Wykorzystuje ona naturalny mechanizm wytwarzania przez limfocyty T cytokin, takich jak interferon gamma. ELISPOT to niezwykle czuła metoda, od lat wykorzystywana jest w diagnostyce utajonego zakażenia prątkami gruźlicy i stanowi alternatywę dla próby tuberkulinowej.

Zasada działania testu ELISPOT

Technika ELISPOT pozwala na wizualizację pojedynczych komórek produkujących interferon gamma. Jest jedyną metodą, która umożliwia określenie rzeczywistej aktywności wydzielniczej badanych komórek. Stanowi połączenie techniki immunoenzymatycznej fazy stałej z krótkoterminową hodowlą komórkową.

ELISPOT polega na stymulacji w warunkach in vitro limfocytów T, wyizolowanych z krwi obwodowej pacjenta, wysokospecyficznymi antygenami bakteryjnymi lub wirusowymi. W sytuacji wcześniejszego kontaktu z patogenem dochodzi do produkcji interferonu gamma przez komórki T, który przy użyciu przeciwciał wyznakowanych enzymatycznie można zwizualizować jako plamki na dnie studzienki płytki
ELISPOT.

Standardowa procedura wykonania testu z użyciem techniki ELISPOT wygląda w następujący sposób:

• W pierwszej kolejności od pacjenta pobiera się próbkę krwi pełnej, wykorzystując najczęściej probówki z heparyną litową. Z krwi izoluje się jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, czyli PBMC, w skład których wchodzą limfocyty T. Komórki są następnie przemywane, aby pozbyć się czynników interferujących i liczone w celu przygotowania wystandaryzowanej zawiesiny komórkowej dla każdego pacjenta.
• Następnie odpowiednia liczba komórek jest nanoszona na płytki mikrotitracyjne i stymulowana wysokospecyficznymi antygenami, np. prątka gruźlicy, wirusa SARS-CoV-2 lub CMV.
• W przypadku wcześniejszego kontaktu pacjenta z patogenem dochodzi do produkcji interferonu gamma, który jest wychwytywany przez specyficzne przeciwciała opłaszczone na dnie studzienek testowych. Następnie dodawane jest drugorzędowe przeciwciało wyznakowane enzymatycznie, wiążące się z wychwyconą cytokiną, a w dalszej kolejności substrat, który w obecności enzymu przekształca się w barwny produkt. W następstwie tej reakcji w dołkach płytki powstają tzw. spoty, czyli plamki.
• Ostatnim etapem jest policzenie dużych, okrągłych, wyraźnych i ciemnoniebieskich plamek. Każda plamka oznacza jedną komórkę T reagującą na dany antygen i wydzielającą interferon gamma. Na podstawie liczby plamek wydawany jest wynik.

Test T.SPOT można przeprowadzić w sposób manualny, jak również istnieje możliwość automatyzacji poszczególnych jego etapów, takich jak izolacja i liczenie komórek PBMC oraz zliczanie plamek w celu interpretacji wyniku. Ten końcowy etap można przeprowadzić nawet przy użyciu szkła powiększającego, a także mikroskopu lub stosując bardziej zaawansowaną technologię w postaci czytnika płytek ELISPOT.

Porównanie technik ELISPOT i ELISA do oceny odpowiedzi komórkowej

Do oceny immunologicznej odpowiedzi komórkowej stosuje się zarówno technikę ELISPOT, jak i testy ELISA, które służą do pomiaru stężenia interferonu gamma uwalnianego przez limfocyty T po stymulacji specyficznymi antygenami. Cel badania jest zatem taki sam. Jakie są jednak różnice pomiędzy obiema metodami?

Według wielu badań naukowych testy oparte o technikę ELISPOT wykazują wyższą czułość niż testy oparte o metodę ELISA. Wpływają na to trzy główne czynniki: po pierwsze, w testach ELISPOT interferon gamma jest wychwytywany wokół komórki wydzielającej, bez rozcieńczenia w supernatancie, bez ryzyka zdegradowania przez proteazy lub wychwycenia przez receptory komórek znajdujących się w pobliżu. Testy ELISA mierzą natomiast stężenie interferonu w fazie ciekłej, czyli globalną odpowiedź limfocytów na stymulację antygenami, przez co nie można uzyskać informacji, ile komórek produkuje daną cytokinę.

Po drugie, w przeciwieństwie do testów ELISA, które pozwalają na ilościowy pomiar wytworzonego interferonu gamma przez wszystkie komórki w hodowli, w testach ELISPOT materiał wyjściowy jest tak rozcieńczany, aby uzyskać podobną liczbę PBMC u każdego pacjenta. Standaryzacja liczby komórek jest szczególnie istotna w przypadku badania pacjentów o obniżonej odporności.

Ponadto, przemywanie komórek zapobiega ingerencji czynników obecnych w surowicy oraz zapewnia specyficzne wiązanie IFN-gamma uwalnianego z limfocytów T uwrażliwionych na dany antygen tylko podczas etapu inkubacji na płytce.

Podsumowując, testy oparte o metodę ELISPOT są zoptymalizowane zarówno pod kątem liczby komórek, jak i warunków hodowli. Oznacza to, że metodyka tego badania obejmuje standaryzację liczby komórek, a interferujący wpływ czynników pochodzących z krwi jest niwelowany, co czyni go najbardziej czułym i specyficznym testem do pomiaru odpowiedzi limfocytów T.

Kiedy warto wybrać test oparty o metodę ELISPOT?

Kiedy zatem warto wybrać testy oparte o metodę ELISPOT? Testy ELISPOT zyskują na znaczeniu szczególnie w przypadku pacjentów z obniżoną odpornością, u których występuje limfopenia. Jak już wcześniej wspomniałam, dla każdego pacjenta standaryzuje się liczbę limfocytów poddanych analizie, tak aby wynosiła ona 250 000 komórek PBMC na jedną studzienkę reakcyjną. Wykonanie testu z zastosowaniem metody ELISPOT jest zatem szczególnie zalecane u osób z grupy podwyższonego ryzyka, np. po chemioterapii, przyjmujących leki immunosupresyjne, po przeszczepie narządów, zakażonych wirusem HIV, chorych na choroby autoimmunizacyjne, a także u dzieci czy osób starszych.