ICAP 2019 – co nowego?

Wybierz język:

  • Polski
  • Angielski

Wywiad z Profesorem Luisem E.C. Andrade z Zakładu Reumatologii Państwowej Akademii Medycznej w São Paulo oraz Wydziału Immunologii w Laboratorium Fleury w São Paulo (Brazylia)

 

Małgorzata Kozłowska (Mko): Czy mógłby Pan Profesor powiedzieć, jaki był główny powód zainicjowania grupy ICAP oraz jakie są jej główne zadania?

Luis E.C. Andrade (LA): Jak wiadomo, ocena testu opartego o metodę immunofluorescencji pośredniej (IIFT) na komórkach linii HEp-2 jest w pewnym stopniu subiektywna. Z tego powodu ludzie na całym świecie raportują wyniki IIFT w nieco inny sposób. W roku 2000 podjęliśmy w Brazylii inicjatywę ujednolicenia nomenklatury wzorów świeceń ANA (IIFT na komórkach HEp-2) – Brazilian Consensus Initiative. Okazała się ona bardzo udana i w kolejnych latach odbyły się kolejne jej edycje. Rozpoczęliśmy stopniowy proces kształcenia techników i ekspertów laboratoryjnych w całym kraju, a z czasem wzbudziliśmy również zainteresowanie klinicystów. Zachęciło nas to do zorganizowania na wzór naszej brazylijskiej inicjatywy przedsięwzięcia o charakterze globalnym i postanowiliśmy zmotywować do tego światowej klasy specjalistów. W 2014 roku podczas XII Międzynarodowych Warsztatów na temat Autoprzeciwciał i Autoimmunologii (XII International Workshop on Autoantibodies and Autoimmunity, IWAA) w São Paulo, w Brazylii, skorzystaliśmy z okazji, aby wypromować inauguracyjne warsztaty Międzynarodowego Konsensusu w sprawie Typów Świeceń ANA (ICAP, ang. International Consensus on ANA Patterns). To był początek – wraz z grupą ekspertów z różnych części świata (każdy z nich odpowiadał za jeden z obszarów komórki) wypracowaliśmy kompromis i zbudowaliśmy algorytm klasyfikacji. Schemat ten był oparty na modelu brazylijskim, został jednak zmodyfikowany przez uczestniczących w przedsięwzięciu specjalistów. Naszym głównym celem jest promowanie harmonizacji oraz standaryzacji w zakresie nomenklatury stosowanej do opisu wzorów fluorescencji, uzyskiwanych metodą IIFT z zastosowaniem komórek linii HEp-2. Jest nim także promowanie wiedzy na temat znaczenia klinicznego konkretnych wzorów świeceń, a także najlepszych potencjalnych zastosowań testu.

 

MKo: Co nowego znajdziemy w rekomendacjach ICAP 2019? Jakie są główne zmiany w kryteriach klasyfikacji, co w nich jest zupełnie nowego i ważnego dla klinicystów oraz diagnostów laboratoryjnych?

LA: Myślę, że jednym z najważniejszych kroków jest wypracowanie konsensusu co do samej nazwy testu (przeciwciała przeciwjądrowe, ANA). Pewien problem stanowił termin „jądrowe”, ponieważ niektóre znaczące reakcje mogły być zaobserwowane tylko w cytoplazmie lub aparacie mitotycznym. Z tego powodu postanowiliśmy usunąć z nazwy słowo „jądrowe” i zdecydowaliśmy się na jej całkowitą zmianę. Obecnie rekomendowanym przez nas terminem jest „test immunofluorescencyjny HEp-2” – w skrócie: HEp-2 IFA (HEp-2 immunofluorescence assay). Dzięki temu można powiedzieć, że wynik testu jest dodatni nawet w próbce, dla której obserwuje się jedynie fluorescencję cytoplazmy lub aparatu mitotycznego. Pracujemy także nad propozycją standardowego formularza wyniku badania, który mógłby być stosowany przez wszystkie laboratoria. Jednakże będzie to raczej sugestia – zamieścimy w nim zarówno najważniejsze informacje, jak i wskażemy na wystąpienie warunków, które mogą wykraczać poza obecny schemat klasyfikacji, np. szczególne kombinacje nakładających się wzorów świeceń mających specyficzne znaczenie kliniczne czy współistnienie wzorów świeceń, które interferują z sobą, tworząc niejasną, trudną do zdefiniowania mieszaninę. Jednym z przykładów mieszanego wzoru świecenia może być połączenie wzoru typu AC-21 (cytoplazmatyczny, wzór mitochondrialny – AMA) oraz AC-6 (Multiple Nuclear Dots – zazwyczaj powiązany z obecnością przeciwciał anty-sp100) – w przypadku takiej kombinacji lub w sytuacji nakładania się na nią dodatkowo fluorescencji błony jądrowej, istnieje znaczne prawdopodobieństwo, że pacjent choruje na pierwotne zapalenie dróg żółciowych (PBC, ang. primary biliary cirrhosis). Oczywiście wzory świecenia w teście HEp-2 IFA stanowią tylko wskazówkę, jakie przeciwciała mogą występować u badanego pacjenta. Ich obecność musi zostać jeszcze potwierdzona za pomocą odpowiednich testów immunologicznych. Inna sytuacja ma miejsce wtedy, gdy widzimy pod mikroskopem mieszaninę wzorów świeceń w tym samym przedziale komórkowym i nie jesteśmy w stanie ocenić, co to właściwie jest za kombinacja. Dla przykładu – w niektórych badanych próbkach znajdują się przeciwciała przeciwko U1-RNP, co daje jądrowy gruboziarnisty wzór fluorescencji (AC-5), oraz przeciwciała przeciwko SS-A/Ro60, które dają wyraźne świecenie drobnoziarniste jądrowe (AC-4). W takiej sytuacji diagności często mają trudności z opisaniem tego, co widzą – czy jest to wzór drobnoziarnisty czy gruboziarnisty, ponieważ żaden z tych wzorów nie jest tak naprawdę dominujący. Jedynym rozsądnym rozwiązaniem jest wówczas zaraportowanie mieszanego jądrowego typu fluorescencji. Wstępna dyskusja nad kategorią mieszanego wzoru fluorescencji odbyła się właśnie tutaj w Dreźnie podczas obecnej edycji ICAP.

 

Małgorzata Klimczak-Filippowicz (MKli): Czy laboratoria w Brazylii używają już nomenklatury ICAP i kodów AC na wynikach badań laboratoryjnych?

LA: To bardzo dobre pytanie! Powiedziałbym, że większość stosuje nomenklaturę ICAP i liczba laboratoriów używających kodów AC stopniowo wzrasta. Myślę, że obecnie jest to nie więcej niż 40% placówek, jednak ta liczba stale rośnie.

 

MKli: Jakie rozcieńczenie zostało przyjęte jako rozcieńczenie wyjściowe (cut-off) ANA w populacji brazylijskiej?

LA: W większości laboratoriów przyjęto rozcieńczenie 1:80.

 

MKli: A jaką wartość przyjęto dla dzieci i młodzieży?

LA: Ta wartość jest stosowana również w diagnostyce dzieci. W Brazylii rozcieńczenie przesiewowe ANA jest takie samo, niezależnie od wieku pacjenta. Z drugiej strony, w przypadku autoprzeciwciał wątrobowych, takich jak przeciwciała skierowane przeciwko aktynie, mięśniom gładkim, LKM, badanie rozpoczynamy od rozcieńczenia 1:10. Dla ANA jest to 1:80 dla wszystkich.

 

MKli: Czy opracowaliście również wzory wskazówek dla klinicystów, które będzie można zamieszczać na wyniku badania laboratoryjnego? Obawiam się, że nie każdy lekarz ma świadomość związku pomiędzy rzadkimi wzorami świecenia a ich znaczeniem klinicznym.

LA: Zdecydowanie tak. Zawarliśmy to w propozycji formularza wyniku badania, który wkrótce opublikujemy. Naszym zdaniem te informacje mają fundamentalne znaczenie, ponieważ żaden klinicysta nie ma obowiązku znać tych wszystkich niuansów. Jest to wiedza, którą musi posiadać diagnosta laboratoryjny. Dla lekarzy przedstawiamy wynik inaczej: „ok, mam taki wzór fluorescencji w takim mianie i takie może być znaczenie tych wyników”.

 

MKo: Jakie są główne trudności w procesie harmonizacji ICAP? Jakie jest największe ograniczenie w przebiegu procesu ujednolicania stosowanej nomenklatury?

LA: Jak można się spodziewać, ludzie zazwyczaj nie lubią zmian w zakresie tego, co robili przez wiele lat. Może to stanowić jeden z problemów, jednakże zaskoczyło mnie to, że kiedy dochodzimy do konsensusu, wszyscy go akceptują i zaczynają postępować zgodnie z ustaleniami. Czasami jednak zdarza się, że nie możemy osiągnąć porozumienia. Ktoś z nas proponuje coś i widzi wyraźnie zalety swojej propozycji, a pozostali członkowie zgromadzenia ich nie dostrzegają. W grupie ICAP zawsze dążymy do konsensusu i postępujemy zgodnie z wypracowanym kompromisem, ponieważ to naprawdę nie ma sensu, aby przeważyła opinia jednej lub dwóch osób. Mechanizm wypracowywania konsensusu czasem prowadzi do tego, że postęp następuje być może trochę wolniej, niż tego oczekujemy, jednak myślę, że to jest dobre. Ostatecznie jest to właściwe, gdyż jesteśmy spójni i bardzo konsekwentni.

 

MKli: Od dwudziestu lat zajmuję się zawodowo diagnostyką ANA i muszę przyznać, że przez ten czas w Polsce bardzo się ona zmieniła. Kiedy rozpoczynałam pracę, w każdym laboratorium stosowano inną nomenklaturę na określenie tych samych wzorów fluorescencji. Lekarze z jednego szpitala nie mogli zrozumieć wyniku badania wydanego w innej placówce. Nomenklatura ICAP zostanie zaadaptowana i wdrożona także w Polsce, ponieważ diagności laboratoryjni chcą wystandaryzować wyniki badań, aby móc monitorować zmiany wzorów świeceń u poszczególnych pacjentów w trakcie przebiegu choroby.

LA: Tak, to prawda! Głównym celem ICAP jest ujednolicenie nomenklatury. W trakcie tego procesu zdaliśmy sobie sprawę, że w niektórych krajach, a może nawet w wielu krajach, ludzie nie byli świadomi tego, jak ważne jest spojrzenie na wzór fluorescencji. W wielu miejscach ludzie koncentrowali się głównie na rozróżnieniu pozytywnych i negatywnych wyników badań, niektórzy określali miano przeciwciał, a ci, którym zależało na określeniu wzoru świecenia, rozróżniali tylko 3 lub 4 rodzaje fluorescencji typu jądrowego – i to było wszystko. Obecnie większość ludzi rozumie, że przy interpretacji wyniku badania HEp-2 IFA sytuacja wygląda analogicznie do opisu wyniku tomografii klatki piersiowej, gdzie nie wystarczy stwierdzenie „występują zmiany bądź nie”. Należy zdefiniować wzór zmian: jaki jest stopień i rodzaj zwłóknienia, czy są to zmiany „o charakterze mlecznej szyby”, czy dominują w części podstawnej płata, czy powstaje jama opłucnowa itp. Każda z tych cech ma związek z różnymi chorobami płuc. Podobnie jest w przypadku wyniku badania HEp-2 IFA – wzory fluorescencji dają informacje na temat możliwych rodzajów przeciwciał, które występują u badanego pacjenta i ich znaczenia klinicznego. Obecnie wiele osób zdaje już sobie z tego sprawę.

 

Questions connected with lecture “The behavior of pattern and titer of HEp-2 IFA in lupus patients according to disease activity status” held on 14th Dresden Symposium on Autoantibodies.

 

MKli: Chciałabym zadać kilka pytań dotyczących Pańskiego wykładu wygłoszonego w trakcie 14. Sympozjum na temat Autoprzeciwciał w Dreźnie. Jaki jest najczęściej obserwowany wzór fluorescencji u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE) w populacji brazylijskiej?

LA: Powiedziałbym, że AC-1 (jądrowy homogenny) – jest to jeden z najczęściej obserwowanych wzorów świecenia, również AC-5 (jądrowy gruboziarnisty) oraz AC-4 (jądrowy drobnoziarnisty), ale wielu pacjentów z toczniem ma również mieszany wzór fluorescencji, co oznacza, że pod mikroskopem widzimy kombinację różnych wzorów świeceń. Wynika to z tego, że pacjenci z toczniem „lubią” produkować wiele autoprzeciwciał, dlatego ostateczny wynik badania to nie czysty wzór AC-5 lub wyraźny AC-1, ale może to być wzór mieszany. Dzięki rozcieńczaniu badanej próbki możliwe jest uzyskanie wyraźnego wzoru w kolejnych rozcieńczeniach, ale te 3 (AC-1, AC-4 oraz AC-5) są najczęściej obserwowane u pacjentów z SLE.

 

MKli: Powiedział Pan, że miano przeciwciał jest istotne dla aktywności choroby. Byłam zaskoczona relatywnie wysokim mianem przeciwciał u pacjentów w stanie remisji – to było 1:640. Czy mógłby Pan to skomentować?

LA: Jeżeli chce się zobaczyć różnicę w mianie przeciwciał w zależności od stopnia aktywności choroby, należy użyć dużych rozcieńczeń. Jeżeli zastosuje się rozcieńczenia rzędu 1:2560 lub 1:5120, to zacznie się dostrzegać, że pacjenci w aktywnym stadium choroby mają wyższe miano przeciwciał niż ci, którzy są w remisji. Chociaż ta różnica w mianie jest wyraźnie dostrzegalna w grupie pacjentów, to pojedynczy pacjenci będący w remisji również mogą wykazywać duże miano. Zazwyczaj zdarza się tak w przypadku przeciwciał anty-RNP, gdyż właśnie te immunoglobuliny nie mają tendencji do korelowania z aktywnością choroby. W takich przypadkach najczęściej obserwowanym wzorem fluorescencji jest typ jądrowy gruboziarnisty (AC-5). Z drugiej strony, u większości pacjentów z SLE będących w stanie remisji i wykazujących jądrowy homogenny typ fluorescencji (AC-1) miano przeciwciał jest niskie.

 

MKli: Jakie są Pańskie rekomendacje dla lekarzy? Czy uważa Pan, że monitorowanie pacjentów, wraz z określaniem miana kontrolnego w trakcie przebiegu choroby, może być użyteczne w praktyce klinicznej?

LA: Jest to trudna kwestia, ponieważ to, co pokazałem, jest sprzeczne z tym, co czytamy i słyszymy – że miano ANA nie zmienia się w trakcie przebiegu tocznia. Nasze wyniki pokazują, że ich miano zmienia się, a te zmiany są powiązane ze statusem aktywności choroby! Zauważyliśmy jednak, że przeciwciała przeciwjądrowe mają umiarkowaną wartość w kontekście oceny aktywności choroby – nie jest to nadzwyczajny biomarker. A ponadto – dodanie dodatkowego testu zwiększa koszty. Z tego względu badanie HEp-2 IFA nie jest lepsze od tradycyjnych parametrów stosowanych w monitorowaniu aktywności tocznia.

 

MKli: A co z testami ilościowymi, takimi jak oznaczenie przeciwciał skierowanych przeciwko dsDNA lub nukleosomom? Czy są użyteczne do monitorowania przebiegu choroby?

LA: Zaletą tych dwóch parametrów jest to, że można je skwantyfikować. W wielu badaniach opisanych w literaturze potwierdzono, że stanowią one umiarkowanie dobre biomarkery aktywności choroby. Osobną kwestią pozostaje fakt, że obecnie nie ma naprawdę dobrego biomarkera do oceny aktywności tocznia. Najlepsze wydaje się połączenie kilku parametrów z obserwacją kliniczną pacjenta – i właśnie tak postępujemy w praktyce. Wykorzystujemy multiparametrowe podejście do badań laboratoryjnych wraz z parametrami klinicznymi, które są bardzo ważne – w ten sposób oceniamy aktywność choroby.

 

MKli: Pokazał nam Pan wyniki monospecyficznych testów, w których stwierdzono homogenny wzór fluorescencji. U części pacjentów wynik oznaczenia w kierunku przeciwciał anty-dsDNA był pozytywny, u części stwierdzono obecność przeciwciał skierowanych przeciwko nukleosomom, natomiast u części wynik oznaczenia był ujemny. Jaki może być powód homogennego typu świecenia u osób, u których nie potwierdzono obecności żadnych przeciwciał za pomocą testu monospecyficznego?

LA: Kiedy zauważamy wzór fluorescencji typu AC-1, zawsze myślimy o przeciwciałach skierowanych przeciwko ds-DNA lub przeciwko nukleosomom. Jest to poprawne podejście, jednakże wykazaliśmy, że wcale nie tak rzadko w próbce o jednoznacznym wzorze fluorescencji typu AC-1 nie ma żadnego z tych dwóch przeciwciał. Jedną z przyczyn takiej sytuacji może być obecność przeciwciał skierowanych przeciwko histonom. Przeciwciała te powodują ładne, homogenne świecenie jądra komórkowego. Nadal jednak część pacjentów nie ma żadnego z tych trzech przeciwciał, a w ich przypadku także widać czysty, homogenny jądrowy wzór fluorescencji. Jest to szczególnie częste u pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby typu 1 lub młodzieńczym idiopatycznym zapaleniem stawów. W tych przypadkach za wzór fluorescencji AC-1 odpowiadać może obecność jakichś innych rodzajów autoprzeciwciał, których jeszcze nie zidentyfikowano. Innym, mniej prawdopodobnym, aczkolwiek możliwym wyjaśnieniem może być obecność w próbce przeciwciał, które rozpoznają takie epitopy natywnego DNA, nukleosomów bądź histonów, które nie są eksponowane w testach fazy stałej. Właśnie taka sytuacja została zaobserwowana w przypadku innych rodzajów autoprzeciwciał, takich jak immunoglobuliny skierowane przeciwko fosfolipidom, cytoplazmie neutrofilów (ANCA) czy transglutaminazie tkankowej.

 

MKli i MKo: Bardzo dziękujemy za udzielenie nam wywiadu.

LA: To była dla mnie przyjemność.

 

Rozmawiały: Małgorzata Kozłowska (MKo), Małgorzata Klimczak-Filippowicz (MKli)

Dodaj komentarz

Twój adres email nie zostanie opublikowany.