Winfried

Neuroimmunologia – nowe możliwości badań w zasięgu ręki

Wybierz język:

  • Polski
  • Niemiecki
  • Angielski

Wywiad z Założycielem i Dyrektorem Generalnym EUROIMMUN AG – Profesorem Winfriedem Stöckerem

 

Czy możesz nam opowiedzieć o historii odkryć w dziedzinie autoimmunologicznych chorób neurologicznych?

Wkrótce po wprowadzeniu testów immunofluorescencji pośredniej, u pacjentów cierpiących na różne choroby neurologiczne wykryto autoprzeciwciała reagujące z tkanką nerwową. Pierwsze odkrycia dotyczyły przeciwciał przeciw antygenom wewnątrzkomórkowym: jądrom neuronów (przeciwciała takie, jak anty-Hu i anty-Ri), a także cytoplazmie komórek Purkiniego (na przykład przeciwciała anty-Yo).

Autoprzeciwciała anty-Hu występują szczególnie w przypadku schorzeń neuronów czuciowych i zapalenia mózgu, zajmującego głównie pień mózgu, móżdżek i układ limbiczny. Często są związane z nowotworami: drobnokomórkowym nowotworem płuc (SCLC), nerwiakiem zarodkowym, nowotworem gruczołu krokowego. Przeciwciała te mogą wcześnie wskazywać na występowanie nowotworu.

Autoprzeciwciała przeciw onkoneuralnym białkom Ri, NOVA-1 i NOVA-2, wykryto w zespole opsokloniczno-mioklonicznym w związku z nowotworem, głównie nowotworem piersi, ale także z drobnokomórkowym nowotworem płuc. Przeciwciała anty-Ri mogą być pierwszą oznaką nowotworu.

Autoprzeciwciała anty-Yo wskazują na paranowotworowy (paraneoplastyczny) zespół móżdżkowy. Zazwyczaj są one również związane z konkretnymi nowotworami, najczęściej nowotworem jajnika, piersi i macicy, ale obserwowano je również przy nowotworze gruczołu krokowego czy gruczolakoraku przełyku. W wielu przypadkach zespół móżdżkowy jest diagnozowany przed nowotworem.

Do końca XX wieku diagnostyka ograniczała się do opisanych autoprzeciwciał i kilku innych przeciwciał przeciwko antygenom wewnątrzkomórkowym, a reakcje z cytoplazmą zamrożonych skrawków tkanki nerwowej uznawano za „niespecyficzne”. Dziś wiadomo, że tak naprawdę są to reakcje przeciwciał z powierzchnią neuronów, szczególnie z neuroreceptorami. Przełomem było odkrycie przeciwciał przeciw akwaporynie 4 (antygenowi kanałów wodnych, 2004) i receptorowi kwasu glutaminowego typu NMDA (kwas N-metylo-D-asparaginowy, 2007), a także przeciw białkom związanym z kanałami potasowymi (LGI1 i CASPR2, 2010). Od tego czasu każdego roku odkrywamy wiele nowych autoprzeciwciał przeciw tkance nerwowej.

W diagnostyce laboratoryjnej badanie autoprzeciwciał przeciw akwaporynie 4 służy do potwierdzenia diagnozy neuromyelitis optica (NMO, zapalenie nerwów wzrokowych i rdzenia, zespół Devica). Objawy NMO to ostre zaburzenia widzenia, aż do przejściowej utraty widzenia w jednym lub obu oczach w ciągu kilku godzin do kilku dni, a także objawy paraplegii z częściowo zaostrzającymi się objawami.

Zapalenie mózgu z przeciwciałami przeciw receptorowi NMDA jest chorobą autoimmunologiczną, opisaną po raz pierwszy w 2007 roku. W niektórych przypadkach wiąże się ono z potworniakiem jajników (rzadko jąder; tkanka nowotworowa zawiera między innymi struktury nerwowe). Pierwszymi objawami są często napady padaczkowe i zaburzenia świadomości oraz objawy podobne do katatonii. Charakterystyczna jest obecność autoprzeciwciał przeciw receptorowi NMDA w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym.

Autoprzeciwciała przeciw LGI1 są w ≥90% przypadków związane ze specyficzną postacią autoimmunologicznego limbicznego zapalenia mózgu. Autoprzeciwciała przeciw CASPR2 występują przeważnie (w 53%) u pacjentów cierpiących na neuromiotonię lub zespół Morvana oraz na zapalenie mózgu. Należą one do grupy fakultatywnych przeciwciał w zespołach paraneoplastycznych: w 10–30% przypadków zespoły neurologiczne mają etiologię paranowotworową, co oznacza, że wykrycie przeciwciała może wskazywać na obecność nowotworu (grasiczak i inne).

Wskazane jest wykonanie równoległych testów na obecność innych najważniejszych autoprzeciwciał przeciw antygenom onkoneuronalnym (ponad 50 autoprzeciwciał), co w wielu przypadkach daje szybką i pewną (czasami nieoczekiwaną) diagnozę, istotną dla przeżycia pacjenta.

 

Sprawdź dostępne w polskich laboratoriach badania autoprzeciwciał antyneuronalnych

Dynamiczny rozwój neuroimmunologii w latach 1987–2018

 

Jakie są główne kategorie przeciwciał antyneuronalnych?

Określenie „przeciwciała antyneuronalne” wyklucza na przykład przeciwciała przeciw akwaporynie 4, dlatego lepiej jest mówić o przeciwciałach antyneuralnych. Można je podzielić na dwie grupy: przeciwciała antyneuralne przeciw antygenom wewnątrzkomórkowym, takie jak anty-Hu, anty-Ri i anty-Yo, oraz przeciwciała antyneuralne przeciw antygenom zewnątrzkomórkowym, takim jak receptory synaptyczne, oraz innym antygenom powierzchniowym komórki (kanały wodne lub potasowe). Można również podzielić je ze względu na powiązanie z nowotworem: przeciwciała antyneuralne ze współistniejącym nowotworem (przeciwciała onkononeuronalne) lub bez obecności nowotworu.

 

Co wiemy na temat mechanizmu powstawania neurologicznych zespołów paranowotworowych?

Neurologiczne zespoły paranowotworowe (NZP) są powikłaniami chorób nowotworowych, nie są one jednak wywołane bezpośrednio przez nowotwór lub jego przerzuty. Antygeny onkoneuronalne występują w różnych typach nowotworów, a także w prawidłowych komórkach ośrodkowego układu nerwowego. Produkcja autoprzeciwciał jest prawdopodobnie indukowana przez obecność antygenów nowotworu, które są swobodnie dostępne dla układu immunologicznego, w przeciwieństwie do antygenów tkanki nerwowej, które są izolowane poprzez barierę krew–płyn mózgowo-rdzeniowy.

 

Które przeciwciała należy zbadać w przypadku podejrzenia neurologicznego zespołu paranowotworowego?

Wskazane jest badanie nie tylko parametrów wymaganych przez klinicystę, ale jednoczesne i równoległe badanie wszystkich obecnie znanych istotnych autoprzeciwciał przeciwko antygenom onkoneuronalnym i neuronalnym. Dzięki temu w wielu przypadkach (przy co trzeciej pozytywnej reakcji) uzyskuje się szybką diagnozę, która wcześniej mogła nie być brana pod uwagę, a jest istotna dla przeżycia pacjenta. W celu zbadania całego spektrum przeciwciał antyonkoneuronalnych przy użyciu metody immunofluorescencji pośredniej można skorzystać z mozaiki BIOCHIP-ów. Jest to zbiór ponad 20 substratów tkankowych i różnych komórek rekombinowanych, umieszczonych obok siebie na szkiełku reakcyjnym, co umożliwia ich jednoczesną inkubację z próbką pacjenta. Pozytywne wyniki bardzo łatwo jest zidentyfikować dzięki zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego. Wyniki można potwierdzić i uzupełnić, korzystając z metody Immunoblot. W tym celu można zastosować testy typu Westernblot zawierające ekstrakty z móżdżku i hipokampu lub testy Lineblot z antygenami rekombinowanymi. Testy Westernblot zapewniają pełne spektrum antygenów, a Lineblot jedynie wybrane antygeny rekombinowane, których odczyt jest jednak dużo mniej skomplikowany

 

Czym są testy komórkowe (cell-based assay, CBA) i dlaczego są one coraz częściej stosowane w tej dziedzinie?

W monospecyficznych testach na obecność wielu autoprzeciwciał antyneuralnych stosuje się transfekowane komórki HEK (human embryonic kidney cells), w których następuje osobna, monospecyficzna ekspresja różnych antygenów neuralnych.

 

Jakie testy zaleciłbyś jako test podstawowy, od którego powinno się zaczynać badania diagnostyczne pod kątem przeciwciał antyneuralnych?

Złotym standardem w badaniach autoprzeciwciał przeciwko antygenom onkoneuronalnym jest przeprowadzenie testu immunofluorescencji pośredniej przy użyciu zamrożonych fragmentów następujących tkanek naczelnych: hipokampu, mózgu, móżdżku, nerwów obwodowych, jelita płodu, trzustki, wątroby.

Jako przykład weźmy autoprzeciwciała przeciw akwaporynie 4. Ich oznaczenie jest możliwe za pomocą testu radioimmunoprecypitacji (RIPA), ale jego czułość wynosi zaledwie 56%. Alternatywnie można użyć testu immunoprecypitacji fluorescencyjnej (FIPA). Istnieje również test oparty na sortowaniu komórek (FACS), w którym jako docelowy antygen stosuje się komórki HEK-293 transfekowane akwaporyną 4 (AQP-4). Ten test jest jednak zarezerwowany dla wyspecjalizowanych laboratoriów i nie jest wystarczająco dobrze wystandaryzowany.

Metodą z wyboru jest obecnie komórkowy test immunofluorescencji pośredniej z użyciem komórek HEK transfekowanych akwaporyną 4 jako substratem. Przeciwciała przeciwko AQP-4 powodują powstanie w cytoplazmie łatwo rozpoznawalnej, gładkiej do drobnoziarnistej fluorescencji. Czułość konwencjonalnego testu IIFT (z substratami tkankowymi) wynosi 65%, a specyficzność 100%. Czułość można zwiększyć do ponad 85% przez dodanie etapu pośredniego: najpierw próbka, następnie surowica AB jako źródło dopełniacza, następnie znakowane FITC przeciwciało anty-C1q, anty-C3 lub anty-C4. W przypadkach z wynikiem pozytywnym prawie wszystkie obszary tkanki ośrodkowego układu nerwowego wykazują wyraźną fluorescencję w formie smug.

Przy użyciu mozaiki BIOCHIP-ów, zawierającej mrożone skrawki móżdżku, mózgu, hipokampu i nerwu wzrokowego oraz inne substraty, na przykład komórkowe z rekombinowanymi antygenami neuronalnymi, możliwe jest badanie wielu autoprzeciwciał w trakcie jednej inkubacji i jednocześnie zbadanie innych autoprzeciwciał istotnych dla diagnostyki różnicowej. W wielu przypadkach pozwala to na szybkie postawienie pewnej (czasami nieoczekiwanej) diagnozy, istotnej dla przeżycia pacjenta. Do inkubacji używa się równolegle dwóch wyjściowych rozcieńczeń – 1:10 i 1:100. Bada się immunoglobuliny klasy IgA, IgG i IgM – dla większej pewności, prowadząc osobne inkubacje.

 

Jakiego rodzaju próbki powinny być użyte do analizy: sama surowica czy surowica i płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR)?

W większości przypadków testów z użyciem surowicy wyniki uzyskujemy szybciej, a miana przeciwciał są zwykle wyższe niż w płynie mózgowo-rdzeniowym. Jeśli w surowicy nic nie znajdziemy, w indywidualnych przypadkach można wykryć przeciwciała w PMR. Jeśli jednak istnieje podejrzenie choroby o dłuższym przebiegu, bada się poziom przeciwciał w obu płynach, aby poznać ich wartości początkowe.

 

W neurologii autoimmunizacja nie jest jedynym przedmiotem zainteresowania EUROIMMUN. Drugi to choroby neurodegeneracyjne. Czy możesz nam opowiedzieć o biomarkerach, które analizuje się w przypadku tej grupy schorzeń? Czy u pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera zaobserwowano ostatnio jakieś nowe biomarkery/przeciwciała?

Jeśli chodzi o chorobę Alzheimera, rutynowo badane są następujące parametry: patologiczny poziom amyloidów można ocenić, mierząc beta-amyloidy (1–40) i (1–42), natomiast w przypadku patologii białka tau bada się poziom całkowitego białka tau oraz fosforylowanego białka tau w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego. Jednoczesne badanie opisanych parametrów może dać jasny obraz tego, czy u pacjenta rzeczywiście występuje choroba Alzheimera lub inny rodzaj demencji.

W kontekście choroby Alzheimera badane są również inne markery integralności neuronalnej i markery synaptyczne, takie jak BACE-1 (beta-secretase 1) lub neurogranina, w celu lepszego zrozumienia ogólnego mechanizmu występowania i rozwoju choroby.

W innych chorobach neurodegeneracyjnych przydatny może być pomiar innych markerów, na przykład alfa-synukleiny w chorobie Parkinsona czy neurofilamentów w diagnostyce stwardnienia zanikowego bocznego lub w monitorowaniu leczenia stwardnienia rozsianego.

Pomiary poziomu białka tau i neurofilamentów odgrywają ważną rolę również w przypadku urazowego uszkodzenia mózgu.

 

Czy u pacjentów niemieckich z łagodnymi objawami rutynowo przeprowadza się badania diagnostyczne w kierunku choroby Alzheimera?

Aby wesprzeć diagnozę choroby Alzheimera, pomiar białek amyloidowych i białka tau został już uwzględniony w rekomendacjach diagnostycznych. Naszymi głównymi klientami w Niemczech są obecnie laboratoria diagnostyki ogólnej.

Lekarze i pacjenci zyskują coraz większą świadomość w zakresie chorób demencyjnych, a także możliwość wczesnego wykrycia ryzyka rozwoju takiej choroby.

Dlatego coraz więcej pacjentów we wczesnych stadiach łagodnych zaburzeń poznawczych wymaga takiego badania.

 

A leczenie choroby Alzheimera? Czy masz jakieś wieści z branży farmaceutycznej?

Kilka leków przeciwamyloidowych znajduje się w III fazie badań. Potencjalnymi lekami są również te przeciw białku tau oraz inhibitory BACE-1.

Wszystkie główne firmy farmaceutyczne skupiają się na opracowaniu nowych leków, ale obecnie właściwie żadne nie są jeszcze dostępne. Wydaje się jednak, że nadejście przełomu to tylko kwestia czasu. Do tej pory pacjentom pozostaje ćwiczyć pamięć poprzez uczenie się nowych języków lub wierszy.

 

Dziękuję za rozmowę.

 

Rozmawiała: Małgorzata Klimczak-Filippowicz

 

www.antyneuronalne.pl

Dodaj komentarz

Twój adres email nie zostanie opublikowany.