Zakażenie wirusem cytomegalii (CMV) może być szczególnie niebezpieczne dla niektórych grup pacjentów, np. kobiet w ciąży. Ze względu na często niespecyficzny lub skąpoobjawowy przebieg zakażenia w celu potwierdzenia infekcji stosuje się testy laboratoryjne oparte na metodach serologicznych. Interpretacja wyników często stanowi wyzwanie, zwłaszcza jeśli chodzi o odróżnienie świeżych zakażeń CMV od przebytych. Z pomocą przychodzą nowe testy wykrywające swoiste dla danego etapu zakażenia przeciwciała przeciwko wybranym antygenom CMV. Zwiększają one swoistość badania i ułatwiają interpretację wyniku.

Diagnostyka laboratoryjna zakażeń CMV – komu jest potrzebna

Zakażenie ludzkim wirusem cytomegalii jest bardzo powszechne w populacji; ocenia się, że wystąpiło wcześniej u 60–80% osób dorosłych (zależnie od wieku, miejsca zamieszkania, statusu socjoekonomicznego). Cytomegalia najczęściej pojawia się w dzieciństwie i przebiega zwykle łagodnie lub nawet bezobjawowo. Zakażenia CMV są szczególnie niebezpieczne dla pacjentów z obniżoną odpornością, w immunosupresji, np. biorców przeszczepów, i kobiet w ciąży [1]. Zwłaszcza w przypadku tej ostatniej grupy istotne jest, aby diagnostyka laboratoryjna umożliwiała różnicowanie zakażeń świeżych i przebytych.

Wirus cytomegalii jest najczęstszą przyczyną tzw. zakażeń wrodzonych, czyli zakażeń płodu. Szacuje się, że infekcje CMV dotyczą 0,2–2,2% wszystkich noworodków [2]. Zakażenie wrodzone tymże wirusem może skutkować poronieniem, wewnątrzmacicznym ograniczeniem wzrastania płodu oraz różnymi wadami wrodzonymi. Obraz kliniczny choroby zależy od okresu ciąży, w którym doszło do zakażenia. Konsekwencje zakażenia płodu są tym poważniejsze, im wcześniejszy jest to etap ciąży. Z uwagi na neurotropowe właściwości CMV zakażenie płodu wiąże się z wysokim ryzykiem powikłań ze strony ośrodkowego układu nerwowego, w tym poważnych zaburzeń słuchu.

Różnicowanie etapów zakażenia

Po infekcji pierwotnej CMV pozostaje w zakażonym organizmie i przechodzi w stan latentny (nieaktywny, uśpiony), lecz na skutek zaburzenia odporności może dojść do jego reaktywacji (zakażenie wtórne, nawracające). Istnieje również ryzyko powtórnego zakażenia się CMV, ale innym szczepem. Stwierdzenie obecności przeciwciał po pierwotnej infekcji CMV nie oznacza nabycia odporności.

Dla płodu najbardziej niebezpieczne są zakażenia pierwotne u matki (tj. występujące po raz pierwszy w życiu). Ryzyko przezłożyskowej transmisji zakażenia na płód wynosi wówczas 30–40% (dla porównania przy infekcji wtórnej 1–3%) [2].

Diagnostyka laboratoryjna zakażeń CMV – rodzaje testów

Większość przypadków zakażenia wirusem cytomegalii potwierdzana jest za pomocą badań serologicznych. Badania swoistych antygenów wirusa (np. pp65) oraz badania metodą PCR nie są rutynowo wykonywane w diagnostyce infekcji u pacjentów z prawidłową odpornością [1]. Tego typu metody wykorzystywane są głównie w przypadku pacjentów w immunosupresji czy noworodków (z podejrzeniem zakażenia wrodzonego).

Diagnostyka serologiczna zakażeń CMV

Przeciwciała IgM

Pierwotne zakażenie czynnikiem infekcyjnym wywołuje syntezę swoistych przeciwciał klasy IgM oraz wzrost ich miana wraz z upływem czasu, dlatego też wykazanie obecności przeciwciał klasy IgM wskazuje na świeże zakażenie. Jednak zależność tę nie zawsze można odnieść do zakażeń CMV, ponieważ przeciwciała w klasie IgM:

• mogą się utrzymywać przez wiele miesięcy po pierwotnej infekcji CMV (tzw. przeciwciała przetrwałe)
• mogą być obecne w przebiegu wtórnego zakażenia CMV
• mogą być wytwarzane w wyniku nieswoistej poliklonalnej stymulacji układu immunologicznego (z powodu innego zakażenia wirusowego, np. wirusem Epsteina-Barr) [3]

Dodatni wynik testu w kierunku przeciwciał IgM anty-CMV powinien być zatem wskazówką do dalszej diagnostyki [2]. W celu wiarygodnego rozróżnienia między pierwotną a przebytą infekcją lub reaktywacją zakażenia dodatnie wyniki badań przeciwciał w klasie IgM powinny być potwierdzone przez dalsze testy serologiczne.

Przeciwciała IgG

Swoiste przeciwciała klasy IgG pojawiają się w późniejszej fazie zakażenia, a obecność jedynie przeciwciał tej klasy (bez obecności przeciwciał klasy IgM) często przemawia za infekcją przebytą. Przeciwciała IgG powstałe w wyniku pierwotnej infekcji zwykle utrzymują się do końca życia.

W związku z możliwymi wątpliwościami dotyczącymi uzyskanego wyniku pomocne w diagnostyce serologicznej są dodatkowe badania:

• badanie drugiej próbki surowicy po upływie określonego czasu, zwykle 2–4 tygodni, i wykazanie serokonwersji (pojawienie się przeciwciał u pacjenta wcześniej seronegatywnego jest potwierdzeniem aktywnego zakażenia)
• badanie awidności (przeciwciała IgG o wysokiej awidności przeciwko CMV można wykryć dopiero po około 20 tygodniach od momentu zakażenia, co praktycznie wyklucza ostrą infekcję pierwotną)
• badanie przeciwciał przeciwko ściśle określonym antygenom wirusowym

Testy wykrywające swoiste dla danego etapu zakażenia przeciwciała przeciwko wybranym antygenom CMV są nowością na rynku diagnostycznym. Mogą one dostarczyć informacji o fazie infekcji.

Przeciwciała swoiste dla etapu zakażenia – nowoczesna diagnostyka

Obiecującymi narzędziami w diagnostyce serologicznej infekcji CMV są testy oparte na pojedynczych wysokooczyszczonych białkach wirusowych, które otrzymuje się metodami biologii molekularnej [4]. Znanych jest ponad 200 białek CMV, jednakże tylko część z nich została rozpoznana jako antygeny, z którymi reagują krążące we krwi pacjenta przeciwciała. Stworzenie wystandaryzowanych narzędzi serologicznych wymagało precyzyjnego scharakteryzowania antygenów CMV oraz ich epitopów, które są rozpoznawane przez ludzkie przeciwciała w klasie IgM i IgG w różnych stadiach zakażenia. W celu osiągnięcia najwyższej czułości i swoistości testu należy stosować antygeny specyficzne i immunodominujące. Główne antygeny CMV rozpoznawane przez przeciwciała pacjentów zakażonych CMV to m.in. białko tegumentu pp150 (UL32), białko niestrukturalne p52 (pp52, UL44), białko szkieletowe pp28 (UL99) oraz wirusowe glikoproteiny gB (UL55) lub gH (UL75) [5].

NOWOŚĆ! Test anty-CMV gB ELISA (IgG)

Niedawno firma EUROIMMUN opracowała test ELISA określający odpowiedź przeciwciał klasy IgG na glikoproteinę B CMV (gB, UL55). Badanie serologiczne z użyciem tego testu może być stosowane w celu różnicowania pierwotnej i przebytej infekcji CMV. Glikoproteina B wirusa cytomegalii stanowi dominującą wirusową determinantę antygenową indukującą produkcję neutralizujących przeciwciał podczas infekcji, a także jest składnikiem kilku eksperymentalnych szczepionek przeciwko CMV [12].

W przypadku przeciwciał anty-CMV gB klasy IgG obserwuje się wyraźne opóźnienie ich syntezy. Od zakażenia do syntezy (wykrywalnego poziomu) przeciwciał anty-gB mija od 50 do nawet 120 dni [12, 13]. Można więc powiedzieć, że wynik dodatni badania w kierunku przeciwciał IgG anty-CMV gB wskazuje na przebytą infekcję. Sugeruje się również, że może to być dodatkowy parametr umożliwiający różnicowanie pierwotnych i wtórnych zakażeń [14].

Awidność przeciwciał klasy IgG i obecność przeciwciał anty-CMV gB wydają się parametrami komplementarnymi. Oczywiście u niektórych pacjentów można zaobserwować opóźnione dojrzewanie przeciwciał IgG, co skutkuje ich długotrwałą awidnością na niskim poziomie. Może się też zdarzyć, że organizm osoby chorej przez długi czas nie będzie syntetyzować przeciwciał anty-gB CMV.

Test anty-CMV p52 ELISA (IgM)

W wyniku pierwotnej infekcji CMV w pierwszej kolejności dochodzi do syntezy przeciwciał skierowanych przeciwko fosfoproteinom i białkom niestrukturalnym cytomegalowirusa, w tym p52. Zastosowanie testów opartych na antygenie p52 CMV umożliwia precyzyjną diagnostykę świeżych infekcji. Jest to jeden z najwcześniej rozpoznawanych przez układ immunologiczny człowieka antygenów CMV, co prowadzi do syntezy swoistych przeciwciał zarówno w klasie IgM, jak i IgG [5].

Przeciwciała klasy IgM przeciwko p52 są wykrywalne po 2–3 tygodniach od momentu zakażenia, ale ich miano szybko spada – w ciągu 2–3 miesięcy [9]. Wykazano, że przeciwciała anty-CMV p52 (IgM) są wykrywalne zarówno w pierwotnych infekcjach, jak i w przypadku reaktywacji wirusa [10]. Istnieją jednak dowody, że miana przeciwciał anty-p52 w klasie IgM są niższe w przypadku reaktywacji w porównaniu z infekcjami pierwotnymi [11]. Zastosowanie testu anty-CMV p52 ELISA (IgM) umożliwia zatem specyficzną diagnostykę świeżych zakażeń CMV.

Podsumowanie

Próba różnicowania świeżych i przebytych zakażeń CMV może nastręczać trudności, ale jest szczególnie istotna w kontekście niektórych grup pacjentów. Diagnostyka laboratoryjna zakażeń CMV obejmuje cały wachlarz testów opartych na różnych metodach. Ich właściwy dobór ma kluczowe znaczenie dla ustalenia rozpoznania. Dzięki postępowi nauki i technologii dysponujemy dziś nowoczesnymi narzędziami diagnostycznymi – testami w kierunku przeciwciał swoistych dla określonych faz zakażenia. Główne zalety testów na obecność przeciwciał anty-CMV p52 i anty-CMV gB to:

• zwiększenie swoistości badania poprzez zastosowanie antygenów specyficznych dla wirusa
• łatwiejsza interpretacja wyniku
• precyzyjne określenie fazy zakażenia CMV

Piśmiennictwo

1. Pokorska-Śpiewak M. et al. Rekomendacje postępowania w zakażeniach wirusem cytomegalii (CMV).
2. Zalecenia Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych. Przegląd Epidemiologiczny. 2016; 70 (2): 297–310.
3. Sieroszewski P., Bober Ł., Kłosiński W. Zakażenia podczas ciąży. Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia. 2012; 5 (2): 65–84.
4. Khalil A. et al. Congenital cytomegalovirus infection: update on treatment. BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology. 2018; 125 (1): e1–e11.
5. Landini M.P. New approaches and perspectives in cytomegalovirus diagnosis. Progress in Medical Virology. Fortschritte der Medizinischen Virusforschung. Progres èn Virologie Médicale. 1993; 40: 157–177.
6. Greijer A.E. et al. Molecular fine-specificity analysis of antibody responses to human cytomegalovirus and design of novel synthetic-peptide-based serodiagnostic assays. Journal of Clinical Microbiology. 1999; 37 (1): 179–188.
7. Landini M.P. et al. Large scale screening of human sera with cytomegalovirus recombinant antigens. Journal of Clinical Microbiology. 1990; 28 (6): 1375–1379.
8. Ripalti A. et al. Prokaryotic expression of a large fragment of the most antigenic cytomegalovirus DNA-binding protein (ppUL44) and its reactivity with human antibodies. Journal of Virological Methods. 1994; 46 (1): 39–50.
9. Vornhagen R. et al. Early serodiagnosis of acute human cytomegalovirus infection by enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant antigens. Journal of Clinical Microbiology. 1994; 32 (4): 981–986.
10. Grazia Revello M. et al. Development and evaluation of a capture ELISA for IgM antibody to the human cytomegalovirus major DNA binding protein. Journal of Virological Methods. 1991; 35 (3): 315–329.
11. Kaden J., Ludwig U., Preyer R. Serum IgG, IgM, and IgA Antibody Response against Cytomegalovirus-Specific Proteins in Renal Transplant Recipients during primary and secondary/recurrent Infection as determined by Immunoblotting Technique. Transplantationsmedizin. 2005; 17 (2): 61.
12. Landini M.P. et al. Antibody response to recombinant lambda gt11 fusion proteins in cytomegalovirus infection. Journal of Clinical Microbiology. 1989; 27 (10): 2324–2327.
13. Pötzsch S. et al. B cell repertoire analysis identifies new antigenic domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus which are target of neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 2011; 7 (8).
14. Schoppel K. et al. The humoral immune response against human cytomegalovirus is characterized by a delayed synthesis of glycoprotein-specific antibodies. Journal of Infectious Diseases 175.3 (1997): 533–544.
15. Sipewa M.J., Goubau P., Bodéus M. Evaluation of a cytomegalovirus glycoprotein B recombinant enzyme immunoassay to discriminate between a recent and a past infection. Journal of Clinical Microbiology. 2002; 40 (10): 3689–3693.