Diagnostyka COVID-19 od A do Z

Skąd biorą się mity wokół SARS-CoV-2?

Wywiad z dr Karoliną Bukowską-Strakovą z Zakładu Immunologii Klinicznej Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie, KZZPMLD

 

Pani Doktor, z czego wynikają kontrowersje związane z pandemią COVID-19 i jak rodzą się mity na temat wirusa SARS-CoV-2?

Problem z fake newsami dotyczy zarówno testów molekularnych w kierunku SARS-CoV-2, jak i tych kasetkowych. Jeśli chodzi o historię (histerię?), krążącą na portalach społecznościowych, o tym, jakoby sam twórca testów PCR, Kary Mullis (mówimy o roku 1984!), powiedział, że reakcja PCR nie może być użyta do testów diagnostycznych, to fakt jest taki, że nie wypowiedział on nigdy przypisywanych mu słów. Cytat ten zainspirowany został artykułem Johna Lauritsena z 1996 roku, w którym pisano: „PCR is intended to identify substances qualitatively, but by its very nature is unsuited for estimating numbers. Although there is a common misimpression that the viral load tests actually count the number of viruses in the blood, these tests cannot detect free, infectious viruses at all; they can only detect proteins that are believed, in some cases wrongly, to be unique to HIV. The tests can detect genetic sequences of viruses, but not viruses themselves”. Oczywiście wszystko się zgadza! Sam PCR nie służy do oceny ilościowej. Do tego służy jego modyfikacja, czyli real-time PCR. Jeśli real-time PCR – jak w przypadku wirusów RNA – połączony jest z odwrotną transkrypcją (reverse transcription – RT), używa się skrótu qRT-PCR lub RT-qPCR (od quantitative RT-PCR) albo rRT-PCR (od real-time RT-PCR). Do roku 1995 opis zastosowania tej modyfikacji pojawił się w fachowej literaturze raptem 7 razy (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2430684/), stąd wypowiedź z roku 1996 zupełnie nie przekłada się na dzisiejsze realia. Dziś zastosowanie w różnych działach diagnostyki medycznej zarówno metody PCR, jak i jej modyfikacji, real-time PCR, jest tak powszechne, że od dawna metody te nie są już nawet uważane za szczególnie nowoczesne. Odnoszenie do dzisiejszych realiów wypowiedzi sprzed 25 lat ma taki sens jak porównywanie realiów medycznych z czasów pomysłodawcy terapii genowej czy procedur przeszczepiania narządów do dzisiejszych procedur.

W Internecie pojawiły się też „przełomowe” rewelacje, że test PCR nie jest swoisty dla materiału genetycznego SARS-CoV-2, ponieważ sekwencje starterów, które udostępnia WHO (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2), wykrywają również ludzki materiał genetyczny i stąd tyle wyników dodatnich. Oceniając komplementarność sekwencji starterów podanych przez WHO w bazie NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), nie znajdujemy jednak żadnego specyficznego „produktu” w genomie ludzkim, a na poziomie mRNA jedynie trzy wersje jednego transkryptu o wielkości przekraczającej 2,5 tys. par zasad, i to tylko częściowo pokrywające się z matrycą (Template) (źródło: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1606766425&job_key=wsgdsROHHi85FY4Qg3CqIvlruxDUeKAN1Q).

 

 

Powstawanie takiego „produktu” nie może być efektywnie odczytane w reakcji real-time PCR z wielu powodów:

  • potencjalnie powstający produkt ma długość 2519 (!) par zasad – tak długa sekwencja nie może się w całości zamplifikować w zadanym czasie cyklu reakcji PCR. Aby efektywnie monitorować reakcję PCR w czasie rzeczywistym, projektuje się startery obejmujące sekwencję docelową, tak by uzyskać fragment (produkt) o długości ok. 200 par zasad. Polimeraza użyta w tym teście (https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Platinum_Taq_DNA_Polymerase_UG.pdf) ma optymalną wydajność syntezy ok. 1000 par zasad w ciągu 60 sekund w temp. 72°C (etap elongacji), stąd w cyklach temperaturowych rekomendowanych w tym zestawie (30 sekund, 58°C) tak długi fragment po prostu nie ma szans powstać;
  • niezgodności w sekwencji starterów (widoczne na rysunku nie jako kropki, ale jako litery) są przy końcu 3’ – niezgodność sekwencji od tego końca uniemożliwia wiązanie startera i dalszą amplifikację. Niezgodności co do pojedynczego nukleotydu na tym końcu są nawet podstawą testów do detekcji znanych mutacji punktowych;
  • w reakcji stosuje się dodatkowo sondę wykrywającą „środek” powstającego produktu, co dopiero da sygnał w czasie syntezy amplifikowanego fragmentu. Potencjalny „produkt” na bazie ludzkich genów nie zawiera sekwencji rozpoznawanej przez sondę, więc w ogóle nie powstanie sygnał fluorescencyjny;
  • jeśli test oparty jest o tzw. metody detekcji niespecyficznej (z SYBR green), diagnosta wykryje niespecyficzne produkty, przeprowadzając rutynową analizę krzywej topnienia – krzywa topnienia takiego „produktu” w ogóle nie będzie przypominać oczekiwanej krzywej dla swoistego produktu.

W kwestii testów antygenowych oczywiście problem dotyczy ich nadszarpniętej wiarygodności, spowodowanej publikacją w Internecie słynnego już filmu przedstawiającego ratownika medycznego, testującego sok znanej firmy w kierunku SARS-CoV-2. Pominę fakt, że ratownik pieczołowicie otwiera test po prawej stronie, a dodatni wychodzi test po lewej, który leżał już otwarty – istotne jest to, że test, który zastosował ratownik, nie jest na liście testów rekomendowanych przez WHO, ani nie spełnia polskich wytycznych (https://www.mp.pl/covid19/zalecenia/251401,stanowisko-pteilchz-w-sprawie-wartosci-diagnostycznej-testow-antygenowych-wykorzystywanych-w-rozpoznawaniu-zakazen-sars-cov-2-9112020?fbclid=IwAR3IvPdfzmDjd0vqG-4_jGOx2uFH-44vrPn6fGkGDte1JNGdTzjZMHTGVsA) – jak można zauważyć na filmie, jest to ten test: https://www.healgen.com/if-respiratory-covid-19-antigen. Co ciekawe, producent wskazuje, że test „rozwija się” ok. 15 minut – na filmie reakcja zaszła w kilkadziesiąt sekund i zaszła znacznie szybciej na teście po lewej niż na teście po prawej, co budzi wątpliwości, czy test ten nie został wcześniej spreparowany. Film zrobił wiele szkody co do wiarygodności testów. Jednak czy każdy odbiorca wie, że ratownik stosuje test nierekomendowany przez WHO? Czy rozumie, że testy zwalidowane są pod kątem konkretnego materiału biologicznego? Jeśli testy są przeznaczone do moczu (jak testy ciążowe), nie można oczekiwać, że z krwi również dadzą poprawny wynik. Jeśli przeznaczone są do wymazów z nosogardzieli, nie można oczekiwać, że dadzą poprawny wynik z soku jabłkowego. Tu w grę wchodzi m.in. pH, które może wpłynąć na odczyt (być może sławny już wynik dodatni z mango z początku pandemii również przeprowadzono na kasetkowym teście chromatograficznym). Ten film również powinien uświadomić wszystkim, jak łatwo wygenerować błędne wnioski, nieprawidłowo stosując testy, a należy pamiętać, że pierwsze testy były rzeczywiście fatalnej jakości.

 

Dziękuję.

Rozmawiała: Małgorzata Kozłowska

Dodaj komentarz

Twój adres email nie zostanie opublikowany.