Kay Roehrig

ELISPOT vs. ELISA – when the choice of method matters

Wybierz język:

  • Polski
  • Angielski

ELISPOT vs. ELISA – kiedy wybór metody ma znaczenie?

Wywiad z Kayem Roehrigiem – Specjalistą ds. Wsparcia Technicznego Klienta oraz Ekspertem ds. Szkoleń w firmie Oxford Immunotec, dynamicznie rozwijającej się firmie diagnostycznej.

Od 20 lat produkowane przez firmę Oxford Immunotec testy oparte o technologię ELISPOT mają zastosowanie w diagnostyce chorób, w których dochodzi do odpowiedzi ze strony limfocytów T, takich jak gruźlica oraz COVID-19.

 

Testy produkowane przez Oxford Immunotec są oparte na metodzie ELISPOT. Czy mógłbyś opisać tę technikę i jej zastosowanie?

Technika ELISPOT (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Spot) umożliwia wizualizację uwalniania cytokin (interferonu gamma w przypadku testów Oxford Immunotec) z pojedynczej komórki po stymulacji specyficznymi antygenami.

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC, ang. Peripheral Blood Mononuclear Cell) izoluje się z krwi pełnej poprzez wirowanie w gradiencie gęstości lub selekcję pozytywną za pomocą kulek magnetycznych, a następnie przemywa i zlicza. Komórki te są normalizowane w celu uzyskania standardowej zawiesiny komórkowej – standardowa liczba komórek jest umieszczana na specjalnie zaprojektowanych płytkach mikrotitracyjnych i stymulowana specyficznymi antygenami. Podczas całonocnej inkubacji komórki, które odpowiadają na antygeny, uwalniają interferon gamma, który jest następnie wychwytywany poprzez opłaszczone na dnie studzienek przeciwciała anty-interferon gamma. W kolejnym etapie płytkę przemywa się w celu usunięcia komórek i dodaje drugorzędowe przeciwciało wyznakowane enzymatycznie, które wiąże się z kompleksem przeciwciało–interferon gamma. Następnie dodawany jest substrat, który w obecności enzymu przekształcany jest w barwny produkt. W efekcie na dnie studzienek testowych można zaobserwować plamki świadczące o liczbie komórek T uwrażliwionych na dany antygen.

Technika ELISPOT charakteryzuje się wysoką czułością wykrywania komórek wydzielających cytokiny, dzięki czemu jest szeroko stosowana w badaniach nad infekcjami, nowotworami, alergiami, chorobami autoimmunizacyjnymi, a także w opracowywaniu szczepionek.

Jakie są zalety techniki ELISPOT w porównaniu z innymi metodami oceny odporności komórkowej?

Test ELISPOT określa ilość efektorowych komórek T specyficznych wobec antygenu, podczas gdy test ELISA opiera się na pomiarze masowej produkcji interferonu gamma przez wszystkie komórki obecne w danej próbce. Testy ELISPOT są bardziej czułe niż konwencjonalne metody ELISA, ponieważ wychwytują docelową cytokinę bezpośrednio w sąsiedztwie komórki wydzielającej, zanim zostanie ona rozcieńczona w supernatancie, związana przez receptory sąsiedniej komórki lub zdegradowana przez proteazy. W ten sposób ELISPOT może wykryć pojedynczą uwrażliwioną komórkę T w populacji 250 000 białych krwinek.

Technika ELISPOT jest od wielu lat stosowana w diagnostyce gruźlicy utajonej. Która grupa pacjentów odnosi największe korzyści z testu T-SPOT.TB i dlaczego?

T-SPOT.TB jest z powodzeniem stosowany w różnych grupach pacjentów, również w przypadku osób zakażonych wirusem HIV czy pacjentów z chorobami autoimmunizacyjnymi otrzymujących leki immunosupresyjne.

Leki immunosupresyjne, kortykosteroidy lub środki hamujące działanie czynnika martwicy nowotworu (anty-TNF) są silnymi inhibitorami limfocytów T i mogą zakłócać wydzielanie interferonu gamma. Przemywanie komórek pozwala usunąć czynniki interferujące, a standaryzacja ich liczby zmniejsza ryzyko otrzymania nieprawidłowego wyniku (z powodu niskiej liczby komórek). Dzięki temu, w połączeniu z niespotykaną czułością, test T-SPOT.TB jest idealnym wyborem do badań przesiewowych w kierunku diagnostyki latentnej postaci gruźlicy, szczególnie w grupie pacjentów z obniżoną odpornością.

Test T-SPOT.TB został również  zatwierdzony przez FDA (ang. Food and Drug Administration) do badań przesiewowych w kierunku gruźlicy u dzieci w wieku 2 lat i starszych. Charakteryzuje się bardzo niskim odsetkiem wyników nieokreślonych i wymaga niewielkiej ilości krwi – w przypadku dzieci do 2. roku życia wystarczą tylko 2 ml krwi w probówce pediatrycznej z heparyną litową.

Jakie jest zastosowanie testu T-SPOT.COVID? Jakich informacji dostarcza naukowcom ta metoda?

Określenie aktywności limfocytów T specyficznych dla SARS-CoV-2 pozwala na bardziej kompleksową ocenę stanu immunologicznego osoby po zakażeniu lub szczepieniu, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością, u których nie rozwija się odpowiedź ze strony przeciwciał. Test T-SPOT.COVID w oddzielnych studzienkach testowych wykorzystuje zarówno antygeny kolca (S, ang. spike), jak i nukleokapsydu (N), dzięki czemu pomaga wykryć i odróżnić odpowiedź immunologiczną komórek T po szczepieniu lub zakażeniu wirusem. Test T-SPOT.COVID został opracowany do użytku w rutynowych badaniach diagnostycznych i posiada certyfikat CE.

Firma Oxford Immunotec dysponuje również testem T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 RUO (ang. research use only), który został opracowany do użytku w badaniach naukowych. Test ten wykorzystuje kilka oddzielnych studzienek do pomiaru odpowiedzi limfocytów T: przeciwko białku kolca (S), nukleokapsydowi (N) i białku membranowemu (M) oraz panel reaktywności krzyżowej zawierający sekwencje peptydowe usunięte z innych paneli ze względu na ich wysoką homologię z endemicznymi koronawirusami. Ten panel może ułatwić badania nad rolą HCoV w odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2. Test był już z powodzeniem stosowany w wielu próbach klinicznych i udowodnił swoją wartość jako narzędzie do monitorowania odpowiedzi komórek T na szczepienie.

Dziękuję za rozmowę.

Rozmawiała: Izabella Podsiadły
EUROIMMUN POLSKA Sp. z o.o.
www.euroimmun.pl

Nie znalazłeś odpowiedzi na nurtujące Cię pytanie? Prześlij je nam, a odpowiedź wkrótce ukaże się na blogu: blog@euroimmun.pl

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.