Testy produkowane przez Oxford Immunotec są oparte na metodzie ELISPOT. Czy mógłbyś opisać tę technikę i jej zastosowanie?

Technika ELISPOT (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Spot) umożliwia wizualizację uwalniania cytokin (interferonu gamma w przypadku testów Oxford Immunotec) z pojedynczej komórki po stymulacji specyficznymi antygenami.

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC, ang. Peripheral Blood Mononuclear Cell) izoluje się z krwi pełnej poprzez wirowanie w gradiencie gęstości lub selekcję pozytywną za pomocą kulek magnetycznych, a następnie przemywa i zlicza. Komórki te są normalizowane w celu uzyskania standardowej zawiesiny komórkowej – standardowa liczba komórek jest umieszczana na specjalnie zaprojektowanych płytkach mikrotitracyjnych i stymulowana specyficznymi antygenami. Podczas całonocnej inkubacji komórki, które odpowiadają na antygeny, uwalniają interferon gamma, który jest następnie wychwytywany poprzez opłaszczone na dnie studzienek przeciwciała anty-interferon gamma. W kolejnym etapie płytkę przemywa się w celu usunięcia komórek i dodaje drugorzędowe przeciwciało wyznakowane enzymatycznie, które wiąże się z kompleksem przeciwciało–interferon gamma. Następnie dodawany jest substrat, który w obecności enzymu przekształcany jest w barwny produkt. W efekcie na dnie studzienek testowych można zaobserwować plamki świadczące o liczbie komórek T uwrażliwionych na dany antygen.

Technika ELISPOT charakteryzuje się wysoką czułością wykrywania komórek wydzielających cytokiny, dzięki czemu jest szeroko stosowana w badaniach nad infekcjami, nowotworami, alergiami, chorobami autoimmunizacyjnymi, a także w opracowywaniu szczepionek.

Jakie są zalety techniki ELISPOT w porównaniu z innymi metodami oceny odporności komórkowej?

Test ELISPOT określa ilość efektorowych komórek T specyficznych wobec antygenu, podczas gdy test ELISA opiera się na pomiarze masowej produkcji interferonu gamma przez wszystkie komórki obecne w danej próbce. Testy ELISPOT są bardziej czułe niż konwencjonalne metody ELISA, ponieważ wychwytują docelową cytokinę bezpośrednio w sąsiedztwie komórki wydzielającej, zanim zostanie ona rozcieńczona w supernatancie, związana przez receptory sąsiedniej komórki lub zdegradowana przez proteazy. W ten sposób ELISPOT może wykryć pojedynczą uwrażliwioną komórkę T w populacji 250 000 białych krwinek.

Technika ELISPOT jest od wielu lat stosowana w diagnostyce gruźlicy utajonej. Która grupa pacjentów odnosi największe korzyści z testu T-SPOT.TB i dlaczego?

T-SPOT.TB jest z powodzeniem stosowany w różnych grupach pacjentów, również w przypadku osób zakażonych wirusem HIV czy pacjentów z chorobami autoimmunizacyjnymi otrzymujących leki immunosupresyjne.

Leki immunosupresyjne, kortykosteroidy lub środki hamujące działanie czynnika martwicy nowotworu (anty-TNF) są silnymi inhibitorami limfocytów T i mogą zakłócać wydzielanie interferonu gamma. Przemywanie komórek pozwala usunąć czynniki interferujące, a standaryzacja ich liczby zmniejsza ryzyko otrzymania nieprawidłowego wyniku (z powodu niskiej liczby komórek). Dzięki temu, w połączeniu z niespotykaną czułością, test T-SPOT.TB jest idealnym wyborem do badań przesiewowych w kierunku diagnostyki latentnej postaci gruźlicy, szczególnie w grupie pacjentów z obniżoną odpornością.

Test T-SPOT.TB został również  zatwierdzony przez FDA (ang. Food and Drug Administration) do badań przesiewowych w kierunku gruźlicy u dzieci w wieku 2 lat i starszych. Charakteryzuje się bardzo niskim odsetkiem wyników nieokreślonych i wymaga niewielkiej ilości krwi – w przypadku dzieci do 2. roku życia wystarczą tylko 2 ml krwi w probówce pediatrycznej z heparyną litową.

Jakie jest zastosowanie testu T-SPOT.COVID? Jakich informacji dostarcza naukowcom ta metoda?

Określenie aktywności limfocytów T specyficznych dla SARS-CoV-2 pozwala na bardziej kompleksową ocenę stanu immunologicznego osoby po zakażeniu lub szczepieniu, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością, u których nie rozwija się odpowiedź ze strony przeciwciał. Test T-SPOT.COVID w oddzielnych studzienkach testowych wykorzystuje zarówno antygeny kolca (S, ang. spike), jak i nukleokapsydu (N), dzięki czemu pomaga wykryć i odróżnić odpowiedź immunologiczną komórek T po szczepieniu lub zakażeniu wirusem. Test T-SPOT.COVID został opracowany do użytku w rutynowych badaniach diagnostycznych i posiada certyfikat CE.

Firma Oxford Immunotec dysponuje również testem T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 RUO (ang. research use only), który został opracowany do użytku w badaniach naukowych. Test ten wykorzystuje kilka oddzielnych studzienek do pomiaru odpowiedzi limfocytów T: przeciwko białku kolca (S), nukleokapsydowi (N) i białku membranowemu (M) oraz panel reaktywności krzyżowej zawierający sekwencje peptydowe usunięte z innych paneli ze względu na ich wysoką homologię z endemicznymi koronawirusami. Ten panel może ułatwić badania nad rolą HCoV w odpowiedzi immunologicznej na zakażenie SARS-CoV-2. Test był już z powodzeniem stosowany w wielu próbach klinicznych i udowodnił swoją wartość jako narzędzie do monitorowania odpowiedzi komórek T na szczepienie.

Dziękuję za rozmowę.

Rozmawiała: Izabella Podsiadły

Tests produced by Oxford Immunotec are based on the ELISPOT method. Could you please describe this technique and its application?

Enzyme-Linked Immunosorbent Spot (ELISPOT) assay allows visualisation of cytokine release (interferon-gamma in the case of the Oxford Immunotec assays) from a single cell after stimulation with specific antigens.

Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are isolated from whole blood either by density gradient centrifugation or positive selection with magnetic beads and then washed and counted. These cells are then normalised to obtain a standard cell suspension, i.e. a standard number of cells are placed in specially designed plates and stimulated with specific antigens. During overnight incubation, the cells that respond to the antigens release interferon-gamma, which is then captured on the bottom of the ELISPOT plates with interferon-gamma antibodies. The plate is washed to remove the cells, and a secondary enzyme-labelled antibody is added that binds to the interferon-gamma-Ab complex. The enzyme substrate is added, and the plate is developed. In a well, each reacting cell produces a spot.

The high sensitivity of ELISPOT makes it a powerful technique for detecting cytokine-secreting cells and is widely used in research on infections, cancer, allergies, and autoimmune diseases, as well as in vaccine development.

What are advantages of ELISPOT in comparison to other methods for assessing cellular immunity?

ELISPOT directly determines the frequency of antigen (Ag)-specific T cells, whereas ELISAs are supernatant-based assays in which measurements are based on the bulk production of interferon gamma by all cells in a given sample. ELISPOT tests are more sensitive than conventional ELISA methods, as they capture the target cytokine directly in the neighbourhood of the secreting cell, before it is diluted in the supernatant, bound by receptors of the neighbouring cell, or degraded. Thus, ELISPOT can detect a single reacting cell in a population of 250,000 white blood cells.

ELISPOT technique has been used for many years in the diagnosis of latent tuberculosis. Which group of patients benefit the most from T-SPOT.TB test and why?

The T-SPOT.TB is equally reliable in different patient groups including difficult samples such as HIV-infected patients or patients with autoimmune diseases receiving immunosuppressive drugs. Immunosuppressants, corticosteroids or anti-tumour necrosis factor (anti-TNF) agents are strong inhibitors of T cells and can interfere with the interferon-γ response. Washing the cells prevents interference from these agents, and standardising the cell count mitigates the risk that a low cell count will affect the patient’s results. Together with unprecedented sensitivity, this makes T-SPOT.TB the perfect choice for TB screening of immunocompromised patients.

The T-SPOT.TB test is also approved by the Food and Drug Administration (FDA) for screening for tuberculosis in children 2 years of age and older. It has a very low invalidity rate and requires a small amount of blood – only 2 ml of blood in a lithium heparin paediatric tube is needed for children up to 2 years of age.

What is the application of the T.SPOT.COVID test? What information does this method provide to the scientist?

Determining the activity of the Sars-CoV-2-specific T cells provides a more comprehensive profile of an individual’s immune status following infection or vaccination, particularly in immunocompromised patients who do not develop antibody responses. The T-SPOT.COVID test uses both Spike (S) and Nucleocapsid (N) antigens in separate test wells and therefore helps detect and distinguish a T cell immune response after COVID-19 vaccination or SARS-CoV-2 infection. The T-SPOT.COVID test is developed and CE marked for use in routine diagnostic applications.

The T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 assay RUO (for research use only, not for use in diagnostic procedures), on the other hand, was developed for use in research and uses several separate wells to measure the T-cell response: three stimulation panels against spike (S), nucleocapsid (N) and membrane protein (M), and a cross-reactivity panel containing peptide sequences removed from the other panels due to their high homology with endemic coronaviruses. The last panel could facilitate research into the role of HCoV in the immune response to SARS-CoV-2 infection. The test has already been successfully used in numerous clinical trials and has proven its value as a tool to monitor T-cell responses to vaccination.

Thank you very much for the interview!

Interviewer: Izabella Podsiadły